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凝胶电泳:变性、天然、还原、氧化条件的选择

a)变性、还原样品

  • 抗体特异性识别目的蛋白的部位(即表面抗原)可能存在于蛋白的三维结构内部。为了能使抗体接近抗原表位,必须将蛋白的三维结构打开,即变性。
  • 要使蛋白变性,用含SDS的上样缓冲液,95-100度煮沸5分钟,或者在70度加热5-10分钟,尤其是研究膜蛋白,因为煮沸更易形成聚集物,而聚集物不能有效进入胶中。
  • 使用SDS,通过SDS阴离子的粘附作用,所有的蛋白质都带有负电荷,SDS通过缠绕多肽链使蛋白变性。SDS以1.4:1的比例结合到蛋白上。
  • 在变性SDS-PAGE中,迁移率不是由多肽固有的电荷数目决定,而是由多肽的分子量决定。SDS的纯度尤为重要,低纯度的或放置时间较长的SDS可引起不明显的蛋白条带和高背景。
  • 使用SDS,通过加入巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT),在蛋白形成自由弯曲之前减少二硫键的形成是非常必要的,使蛋白可按分子量大小来分离。
  • 上样缓冲液中加入甘油能增加样品的密度,使样品停留在样品池的底部,防止外溢和使凝胶上样不规则。
  • 为了能看到蛋白的迁移,通常在上样缓冲液中加入小分子的离子型染料(如溴酚蓝)。
  • 蛋白质样品处理时,加热前后都要用漩涡振荡器彻底混匀样品,使溶解彻底。

b)天然的未还原样品

  • 有些抗体识别的抗原表位在抗原的天然构型中由非临近氨基酸组成。虽然这些氨基酸在原始序列中是彼此分开的,但他们在蛋白的三维结构中是相互靠近的。抗体只能辨认在折叠结构表面上的抗原。
  • 在这样的情况下,进行非还原条件WB是不可避免的。总之,非变性条件就意味着样品和电泳缓冲液中不加入SDS,以及不加热样品。
  • 有些抗体仅识别非还原形式的蛋白质,即氧化形式(特别是半胱氨酸残基)的蛋白质。引起还原的试剂巯基乙醇和DTT必须从上样缓冲液和电泳缓冲液中除去。

蛋白状态
凝胶条件
上样缓冲液
电泳缓冲液
还原-变性
还原-变性
β-巯基乙醇或DTT和SDS
有SDS
还原-天然
还原-不变性
β-巯基乙醇或DTT,无SDS
无SDS
氧化-变性
不还原-变性
无β-巯基乙醇或DTT,有SDS
有SDS
氧化-天然
不还原-天然
无β-巯基乙醇或DTT,无SDS
无SDS

(乐研生物 www.loybio.com)

标签Western_Blot
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共 9 个关于【Western blot凝胶电泳:变性、天然、还原、氧化条件的选择】的回复 最后回复于 2015-11-6 13:55

小小 发表于 2014-2-23 17:30:03 | 显示全部楼层
真心有用,特地注册表示感谢
金海岸 发表于 2014-2-27 17:10:22 | 显示全部楼层
不错!顶楼主
知行合一 发表于 2014-3-7 19:05:30 | 显示全部楼层
总结的很好,学习了
晴天小猪 发表于 2014-3-9 00:58:10 | 显示全部楼层
前来围观
一剑成功 发表于 2014-3-14 15:06:26 | 显示全部楼层
虚心向楼主学习
漂亮蓝影 发表于 2014-3-16 09:39:29 | 显示全部楼层
很好,很实用
淡泊明志 发表于 2014-3-17 13:20:08 | 显示全部楼层
谢谢楼主,收藏
大力水饺 发表于 2014-3-21 11:54:10 | 显示全部楼层
学习了
susanrey 发表于 2015-11-6 13:55:51 | 显示全部楼层
很详细的叙述
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