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Western blot蛋白抽提缓冲液

统统 于 2012-12-8 18:15 发表 [复制链接]

本帖最后由 统统 于 2012-12-8 18:43 编辑

蛋白抽提缓冲液

  • 准备凝胶电泳的样品,需要对细胞和组织进行抽提以释放目标蛋白,这些可溶性蛋白能够穿过分离胶单独移动。

  • 抽提缓冲液有很多种,但用来做WB试验的仅有少数几种。简单来说,他们溶解蛋白的能力不同,含有十二烷基磺酸钠和其他离子型去污剂的溶解能力最强。

  • 抗体能够识别降解和变性蛋白质,因此应该在还原和变性条件下使用该类抗体。需要注意的是,一些抗体只能识别天然的、非变性的蛋白质,故不能识别经去污剂(SDS、脱氧胆酸盐、弱降解作用的Triton-100和NP-40)作用的蛋白质。

  • 专门或主要表达在亚细胞结构区域的蛋白可在细胞裂解物中进行富集。这对于提取弱表达蛋白非常重要。例如:相对于全细胞或全组织裂解物来说,核表达蛋白在细胞核裂解物中占有相当大的比例,这样凝胶条带中可以载入更多的目的蛋白。另一个优点是排除了其他细胞结构的交叉反应。

蛋白定位和抽提液的选择:

样品类型
抽提液
全细胞
NP-40或RIPA
细胞质(可溶性的)
Tris-HCl
细胞质(细胞骨架)
Tris-Triton
膜结合蛋白
膜结合部分NP-40或RIPA
细胞核
RIPA或核抽提液
线粒体
RIPA或线粒体抽提液

  • Nonidet-P40(NP40)缓冲液:这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或者全细胞抽提物等常用的一种缓冲液。如果目的蛋白不能完全从不溶性或凝胶物中抽提,RIPA缓冲液将会更适合,它包含的离子型去污剂能更好溶解蛋白。

  • RIPA缓冲液:这种缓冲液对全细胞提取物和膜结合蛋白都非常有用,对提取细胞核蛋白来说,这种缓冲液比只含有NP40或Triton-100的缓冲液更受欢迎。但它会破环蛋白与蛋白之间的相互作用,因此这在免疫沉淀中会有问题。

注:在需要保存蛋白和蛋白相互作用,或者将蛋白变性剂降到最低,应该使用不含去污剂的缓冲液。用不含去污剂的裂解液,一般需配合机械剪切来裂解细胞,常用的Dounce匀浆器或者将细胞反复通过注射器针头。在简单的情况下Tris缓冲液就足够了,但对于膜结合蛋白或细胞骨架蛋白则需要含有去污剂的缓冲液。

相关链接NP-40缓冲液的配制及使用

                  RIPA缓冲液的配制及使用

(乐研生物 www.loybio.com)

标签Western_Blot
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