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western blot转移电泳一般操作流程
      

总的来说,半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡;滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中;正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。


电泳转膜基本操作流程

电泳转膜基本操作流程




电转缓冲液和电转条件的选择

对于不同的电转设备,当选用不同的胶和缓冲液时,要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间,而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad小型 Mini Trans-Blot转印槽(湿转)和Trans-Blot半干转印系统转印槽(半干转)相应的电转参数如下表:

Mini Trans-Blot槽湿转设备

Mini Trans-Blot槽湿转设备
     

Trans-Blot半干转印系统转印槽

Trans-Blot半干转印系统转印槽




槽式转印
半干转印

Mini Trans-Blot槽
Trans-Blot半干转印系统转印槽
印迹区域(宽 x 长)
10 x 7.5 厘米
24 x 16 厘米
转移参数

凝胶夹数
2
-
缓冲液要求
450ml
≤200 ml
电极距离
4cm
按夹层结构厚度确定
转移时间(高强度)
60分钟
15–60 分钟
冷却
蓝胶冷却装置/冷却旋管
-
凝胶容量

18.3 x 19.3 厘米
-
1 块凝胶(2 块凝胶堆叠)
16 x 20 厘米
-
1 块凝胶(2块凝胶堆叠)
16 x 16 厘米
-
13.3 x 8.7 厘米
-
3 个凝胶并列
8.3 x 7.3 厘米
每个凝胶夹1块凝胶共2个凝胶夹(两种尺寸)
4个凝胶并列
8.6 x 6.8 厘米

通常我们在做湿转的时候,选择100V恒压(高强度,因为低强度时间较长,且效率较低),电流控制在120-350mA之间,分子量在60KD以下的60分钟即可,分子量在60KD以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多(如GAPDH 37KD,Ki67 358KD),你可以考虑将胶从中间分开,两部分分别采用不同时间转印,能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次,之后电流会过大,不适合再使用。

      

而对于半干转,我们一般选择恒流(膜面积的3倍:3 mA/cm2) 之间一般60分钟,同样根据蛋白分子量适当调节时间。

     

需要注意的是:低温对于膜的转印是至关重要的,尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率(胶用考马斯亮蓝加热染色,膜用丽春红染色,均只需几分钟,并不耽误太多时间),不然后面的实验既费时也费抗体。

具体的对于电压/电流的选择,可以参照下表。但合适的电转条件需要根据凝胶的厚度、膜的种类、蛋白分子量、电转缓冲液选择最优化的方案。


SDS-PAGE Gels (Towbin Buffer)

低强度
高强度
Mini Trans-Blot槽
30 V/90 mA, 16 hr
100 V/350 mA, 60 min
Trans-Blot半干转印系统转印槽
N/A
Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min
Isoelectric  Focusing Gels, Native Gels, Basic Proteins, and Acid-Urea Gels (0.7% acetic  acid)

低强度
高强度
Mini Trans-Blot槽
30 V/10 mA, 16 hr
100 V/350 mA, 1 hr
Trans-Blot半干转印系统转印槽
N/A
Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min

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