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实验原理

人周外血T细胞按其表面标志而分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两个亚群,其细胞膜上分别表达CD4或CD8分子。当它们与相应的鼠抗人单克隆抗体结合后,在补体的参与下,可溶解相应的T细胞亚群,从而分离出另一群不能与特异性抗体结合的T细胞亚群。

主要试剂与器材

(1)无天然抗体的细胞毒性的幼兔补体。

(2)抗CD8单抗和抗CD4单抗。

(3)1%FCS-PBS/HBSS和RPMI-1640培养液。

(4)人PBMC或纯化的T细胞悬浮。

(5)细胞分离液。

实验步骤

(1)将细胞悬浮以120rpm离心10min,弃上清,重悬于0.5ml的RPMI-1640中,并与适量的抗CD8单抗反应,置冰浴30min。

(2)用HBSS洗涤细胞2次,以去除游离抗体。

(3)加入新鲜适量的兔补体使细胞重悬,置37℃水浴1h。

(4)离心弃上清,即获得CD4+T细胞。用RPMI-1640洗涤细胞2次,用完全培养液重悬细胞,取样计数并计算细胞毒作用的百分比。。

同样可采用CD4单抗获取CD8+T细胞。一般而言,若抗体选用适当,用本方法所分离的T细胞亚群的纯度与活率均大于90%。

注意事项

(1)采集的补体要求由多只兔血清混合,并小量分装,-20℃保存,反复冻融将影响补体活性。应通过预实验,剔除具天然毒性的兔血清,测定补体介导细胞毒作用的最佳工作浓度。

(2)将抗体作二倍系列稀释,测定其他补体存在的条件下杀死靶细胞的最佳浓度。

(3)注意设立对照组,即只加抗体而不加补体,只加补体而不加抗体,以排除实验系统中抗体或补体的非特异性细胞毒作用。

文章来自将来试剂www.shshiji.com

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共 0 个关于【抗体和补体介导的特异性细胞毒作用分离法】的回复 最后回复于 2013-7-11 14:07

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