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聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)是我们常用于分离蛋白质和寡核苷酸的电泳技术,其作用原理是聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,因而具有分子筛效应。PAGE有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE),两者的特点是:

  • Native-PAGE:在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
  • SDS-PAGE:SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。达到的效果就是SDS-PAGE下,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
两者中尤以SDS-PAGE应用更为广泛。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离胶和浓缩胶的配制

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离胶和浓缩胶的配制


在实际应用中,需要根据目的蛋白的分子量大小需要选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格的成分配制SDS-PAGE的分离胶(Running Gel)和浓缩胶(Stacking Gel)。为了方便使用,我们将其中日常应用最多的10%SDS-PAGE分离胶已用红色加粗字体进行了标识。


不同浓度SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围

SDS-PAGE分离胶浓度
最佳分离范围
6%胶
50-150kD
8%胶
30-90kD
10%胶
20-80kD
12%胶
12-60kD
15%胶
10-40kD


不同浓度SDS-PAGE分离胶的配制成分
  
浓度及成分
  
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
5
10
15
20
30
50
6%胶
蒸馏水
2.6
5.3
7.9
10.6
15.9
26.5
30%Acr-Bis(29:1)
1.0
2.0
3.0
4.0
6.0
10.0
1.5M Tris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
7.5
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.024
0.04
8%胶
蒸馏水
2.3
4.6
6.9
9.3
13.9
23.2
30%Acr-Bis(29:1)
1.3
2.7
4.0
5.3
8.0
13.3
1.5M Tris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
7.5
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.003
0.006
0.009
0.012
0.018
0.03
10%胶
蒸馏水
1.9
4.0
5.9
7.9
11.9
19.8
30%Acr-Bis(29:1)
1.7
3.3
5.0
6.7
10.0
16.7
1.5M Tris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
7.5
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02
12%胶
蒸馏水
1.6
3.3
4.9
6.6
9.9
16.5
30%Acr-Bis(29:1)
2.0
4.0
6.0
8.0
12.0
20.0
1.5M Tris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
7.5
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02
15%胶
蒸馏水
1.1
2.3
3.4
4.6
6.9
11.5
30%Acr-Bis(29:1)
2.5
5.0
7.5
10.0
15.0
25.0
1.5M Tris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
7.5
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02

不同浓度SDS-PAGE浓缩胶的配制成分
成分
配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)
5%胶
2
3
4
6
8
10
蒸馏水
1.4
2.1
2.7
4.1
5.5
6.8
30%Acr-Bis(29:1)
0.33
0.5
0.67
1.0
1.3
1.7
1M Tris, pH6.8
0.25
0.38
0.5
0.75
1.0
1.25
10%SDS
0.02
0.03
0.04
0.06
0.08
0.1
10%过硫酸铵
0.02
0.03
0.04
0.06
0.08
0.1
TEMED
0.002
0.003
0.004
0.006
0.008
0.01

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共 2 个关于【聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离胶和浓缩胶的配制】的回复 最后回复于 2015-5-16 10:15

八大贤人 发表于 2014-3-21 17:57:11 | 显示全部楼层
总结的很好,刚好用到!
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