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本帖最后由 十一 于 2013-6-25 14:36 编辑

实验原理

免疫细胞化学(immunocytochemistry)是根据免疫学原理,利用抗体同特定抗原专一结合,对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子;抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物,再与组织中的抗原发生反应,即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。

常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法(immunofluorescent technique),常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、罗丹明(rhodamine)等。酶标记的称为酶标免疫法(enzyme-labeled antibody method),常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase),酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物,从而显示出抗原存在的部位。

抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种,直接法是将带有标记的抗体与抗原反应,显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上,再用带标记的次级抗体同初级抗体反应,从而使初级反应得到放大,显示增强。

实验步骤

1. 石蜡切片4-5μm;

2. 切片脱蜡至水;

3. 3%甲醇双氧水阻断室温10分钟;

4. 0.01M(PH 7.2)磷酸盐缓冲液洗5分钟′3次;抗原修复,加入0.01M(PH6.0)柠檬酸缓冲液置微波炉中10档3分30秒,之后可进行2档1分至1分30秒微波维持。

5. 自然冷却后洗,加二抗同种动物非免疫血清封闭,室温10分钟;

6. 免洗,倾出血清,分别滴加配制好的一抗4℃过夜;

7. 洗5分钟,3次;

8. 滴加生物素标记的第二抗体,室温孵育10分钟;

9. 洗5分钟,3次;

10. 滴加链亲和素-过氧化物酶,室温10分钟;

11. 洗5分钟,3次;

12. 新鲜配制的DAB溶液显色3-10分钟;

13. 自来水洗,苏木素浅染细胞核,分化。自来水冲洗返兰,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

将来试剂http://www.shshiji.com

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