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RNAiso plus操作说明

研小弟 于 2013-5-19 22:46 发表 [复制链接]
RNAiso plus操作说明

TaKaRa在核酸领域做的还是非常不错的,而且价格公道。我们实验室也因此经常使用TaKaRa的相关产品,由于经常用到,又经常记不住,翻书煞是麻烦,所以这里转载一下,方便自己和需要的同学查阅。以下内容转自TaKaRa产品说明书,相关知识产权归TaKaRa所有:


本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取Total RNA。样品在RNAiso Plus中能够充分被裂解,在加入氯仿离心后,溶液会形成上清层、中间层和有机层(鲜红色下层,含有蛋白质、多糖、脂肪酸、细胞碎片和少量DNA),RNA分布在上清层中,收集上清层,注意不要收集中间层,经异丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。使用RNAiso Plus,Total RNA的提取过程可在1小时内完成。 提取的Total RNA纯度高,基本不含蛋白质及基因组DNA,可以直接用于Northern杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR*等各种分子生物学实验。

*:如果用于RT-PCR实验,即使有少量的基因组DNA也会影响实验结果,因此,实验前应使用Recombinant DNase I (RNase-free)(Code No. 2270A)进行处理。


试剂盒之外所需准备试剂
◆ 氯仿
◆ 异丙醇
◆ 75%乙醇(DEPC处理水配制)
◆ RNase-free水(制备方法:使用RNase-free的玻璃瓶,向超纯水中加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),过夜搅拌后,高温高压灭菌。)

保存和运输
4℃。 避光保存以保持活性。

RNA提取实验前的准备
1、尽量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理。
(1) 用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下处理12小时。
(2) 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。 RNA实验用的器具建议专门使用,不要用于其它实验。
2、使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。如果使用的试剂不能高温高压灭菌,请使用高压灭菌后的仪器盛装,无菌过滤后使用。
3、请使用一次性塑料手套和口罩进行所有试剂配制和实验操作,以避免RNase污染。



实验操作

1. RNAiso Reagent的使用量情况如下。
样品量
RNAiso Plus使用量(ml)
10 cm2的贴壁培养细胞
1~2
5×106~1×107的非贴壁培养细胞
1
100 μl的白细胞
2
50~100 mg的组织样品(易提取RNA)
1
50~100 mg的组织样品(不易提取RNA,如肝、脾、骨及软骨*1等)
2
15~30 mg的植物材料*2(多糖和多酚含量不高的)
1
2~5×107的酵母细胞*3
1
*1: 从骨及软骨提取的RNA时,可选择High-Salt Solution for Precipitation (Plant) (Code No. 9193)和RNAiso Plus配套使用
*2: 从含有大量多糖的植物样本提取时,可选择Fruit-mate. for RNA Purification (Code No. 9192)和RNAiso Plus配套使用
*3: 从酵母中提取RNA时,可选择Yeast Processing Reagent (for total RNA preparation) (Code No. 9089)和RNAiso Plus配套使用


2. 实验样品的研磨和匀浆。

A. 贴壁培养细胞
① 倒出培养液,用1×PBS清洗一次。
② 每10 cm2生长的培养细胞中加入2 ml的RNAiso
Reagent,水平放置片刻,使裂解液均匀分布于
细胞表面并裂解细胞,然后使用移液枪吹打细胞
使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。
③ 将内含细胞的裂解液转移至离心管中,用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④ 室温静置5分钟。

B. 悬浮培养细胞
① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中,8,000 g 4℃离心2分钟,弃上清。
② 向每5×106个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。

C. 动物组织、植物材料样品
① 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。
② 对于普通的RNA提取样品,可以向研钵中加入适量的RNAiso Reagent,将研磨成粉末状的样品完全覆盖, 然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品,如肝、脾、骨及软骨等,可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的 RNAiso Reagent的匀浆管中,把匀浆管置于冰浴中进行匀浆,直至匀浆液呈无颗粒透明状。
③ 将匀浆液转移至离心管中,室温静置5分钟。
④ 12,000 g 4℃离心5分钟。
⑤ 小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。
③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④ 室温静置5分钟。

3. 总RNA的提取。
① 向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Reagent的1/5体积量),盖紧离心管盖,用力震荡(氯仿沸点低、易挥发,振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,再室温静置5分钟。
② 12,000 g 4℃离心15分钟。
③ 从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。
④ 向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15~30℃下静置10分钟。
⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后,试管底部会出现沉淀。

4.RNA沉淀的清洗。
小心弃去上清,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇l ml(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量,应尽量除净乙醇)。
5. RNA的溶解。
室 温干燥沉淀2~5分钟(不可以离心或加热干燥,否则R N A 将会很难溶解, 有关R N A 溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明),加入适量的RNasefree水溶解沉淀,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀,待RNA沉淀完全 溶解后于-80℃保存。


RNA提取操作流程简图

RNA提取操作流程简图

RNA提取操作流程简图


FAQs

[Q1] 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量如下表:
组织材料
起始样品量
TotalRNA提取量
全血*
1ml
15~20μg
白细胞
1×107
约20~40μg
小鼠肝脏
1g
约4,000~5,000μg
HL-60培养细胞
1×107
约100μg
烟草叶片
1g
约1,000μg
小鼠肾脏
1g
约3,000μg
小鼠骨骼肌
1g
约1,500μg
小鼠脑
1g
约1,500μg
鲤鱼骨骼肌
1g
约50μg


[Q2]如果收量少于预期,可能由于以下原因:
① 加入RNAiso后研磨不充分
② 三相分层时,上清液取量过少
③ RNA沉淀没有完全溶解
④ 在异丙醇沉淀或清洗步骤存在RNase污染

[Q3] OD260/OD280值<1.65,为什么?
① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定,低离子强度或低pH值会使OD280值升高。
② 样品裂解时加入的RNAiso Reagent量偏少,造成蛋白变性不充分,可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提,以除去蛋白。
③ 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置,或静置的时间不足5分钟。
③ 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶,而RNAiso Reagent的添加量不够。
④ 相分离后,吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。
⑤ RNA未充分溶解。

[Q4] 提取的RNA不溶怎么办?
① 若75%乙醇清洗沉淀后干燥时间,则RNA沉淀会难以溶解。避免加热或离心干燥沉淀。
② 可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时可有助于沉淀溶解。

[Q5] 提取的RNA降解,为什么?
① 使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料,或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。
② 提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。
③ 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶,而RNAiso Plus的添加量不够。

[Q6] 提取的RNA中含有DNA污染,为什么?
① 裂解组织或细胞使用的RNAiso Plus量偏少。请按用量表添加或多于用量表添加。
② 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂(如:乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。
③ 如果提取的RNA中含有DNA时,可以使用Recombinant DNase I (RNase-free)(Code No. 2270A )进行DNA消化。

[Q7] 提取的RNA中含有多糖怎么办?
大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖,因此很难将其从RNA中除去,使用此类组织材料提取RNA时,建议增加RNAiso Plus的使用量。 对于从含有大量多糖的植物样本中提取RNA时,推荐使用Fruit-mate® for RNA Purification (Code No. 9192)作为预处理试剂。在异丙醇沉淀纯化步骤中加入High-Salt Solution for Precipitation (Plant) (Code No. 9193)可有效除去RNA溶液中的多糖。

[Q8] 如何计算RNA的浓度?
RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl。

■ 参考文献
1. Chirgwin, J. et al ., (1979) Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease , Biochemistry . 18 (24) : 5294-5299.
2. Wallace, D., (1987) Large-and Small-Scale Phenol Extractions , Methods in Enzymology . 152:33-41.
3. Coombs, L. M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann, M., Denner, J. and Knowles, M.A. (1990) Simultaneous Isolation of DNA, RNA, and Antigenic Protein Exhibiting Kinase Activity from Small Tumor Samples Using Guanidine Isothiocyanate, Anal. Biochem . 188: 338-343. 4. Nicolaides, N. C. and Stoeckert, Jr., C. J. (1990) A Simple, Efficient Method for the Separate Isolation of RNA and DNA from the Same Cells, Biotechniques , 8: 154-156.
5. Feramisco, J. R. et al ., Molecular Cloning: 194-195, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY.
6. Raha, S., Merante, F., Proteau, G. and Reed, J. K. (1990) Simultaneous Isolation of Total Cellular RNA and DNA from Tissue Culture Cells Using Phenol and Lithium Chloride, Gene Anal. Techn . 7: 173-177.
乐研生物 www.loybio.com)

TaKaRa官方链接:RNAiso Plus
TaKaRa RNAiso说明书: pdfļ 9108-9109.pdf (359.96 KB, 下载次数: 6)
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