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一次性激活1万个lncRNA:OneShine™ CRISPR/Cas9 lncRNA细胞文库

一次性激活1万个lncRNA:OneShine™ CRISPR/Cas9 lncRNA细胞文库

一次性激活1万个lncRNA:OneShine™ CRISPR/Cas9 lncRNA细胞文库

一次性激活1万个lncRNA:OneShine™ CRISPR/Cas9 lncRNA细胞文库


       此系统包括lentiSAMv2质粒和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒。lentiSAMv2质粒如图一所示,其中,eSpcas9(1.1)也叫做dCas9,是将Cas9酶切位点突变后形成的,它只具有结合基因组和sgRNA的能力,而不具备切割DNA的能力。lentiSAMv2质粒是经过改造的gRNA质粒,在sgRNA后面加入了19个碱基(MS2 binding site)。这19个碱基经过转录后形成一个具有茎环结构的RNA,此RNA能特异性地与MS2蛋白结合。而在另一个载体上,MS2蛋白已经与P65、HSF1蛋白融合。其中,P65、HSF1是两个转录因子。因此,当两个载体同时进入同一个细胞后,lentiSAMv2质粒表达“sgRNA- MS2 binding site“融合RNA及dCas9蛋白,lenti MS2-P65-HSF1_Hygro载体表达MS2-P65-HSF1。在dCas9作用下,则形成“基因组DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2- P65-HSF1”这一超级复合体。当sgRNA为转录起始位点时,此超级复合体定位于转录起始位点,由于P65、HSF1可以募集更多转录因子,因此可启动转录,从而激活转录起始位点后面的基因表达。
       我们合成了9万多个long noncoding RNA转录起始位点的sgRNA(对应1万多个lncRNA),分别载入lentiSAMv2质粒中,再把此9万多个质粒混合起来,形成文库。并且我们将此文库整合到了细胞中,一个125cm2细胞培养瓶中含有约10^8个细胞,每个细胞被激活一个lncRNA,共约1万个lncRNA被激活,所以含有每个特定基因缺陷的细胞约有10000个(10^8/1万)。
二、参数
   靶基因物种:人
   lncRNA数目:10,504
   gRNA数目:96,458
   细胞类型:胃癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞系和永生化的细胞系。
   价格:7万元/株
三、应用
【应用举例:细胞凋亡相关long noncoding RNA筛选】
取细胞文库进行扩增,然后平均分成两份,每一份包含10^8个细胞,每个细胞被激活了一个long noncoding RNA,共约1万个lncRNA被激活,所以含有每个特定激活lncRNA的细胞约有10000个(10^8/1万)。向其中一份细胞中加入放线菌素D、诱导细胞凋亡(A组),在另一份细胞中加入溶剂、作为对照(B组)。A组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞A1、未凋亡细胞A2。B组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞B1、未凋亡细胞B2。分别对A1、A2、B1、B2进行短测序,检测哪些lncRNA被激活了。A2中被激活的lncRNA即为能抵抗凋亡的lncRNA,B1中被激活的即为能诱导凋亡的lncRNA。

四、其他应用
(1)新药靶点确定与验证
(2)环状RNA上游调控机制分析、下游调控机理分析
(3)Long noncoding RNA作用机制验证
(4)脂肪代谢机制研究
(5)干细胞自我更新、不对称性分裂机制等。 该内容最后由 wangsheng0726 于 2017-9-5 09:58 编辑

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共 1 个关于【一次性激活1万个lncRNA:OneShine™ CRISPR/Cas9 lncRNA细胞文库】的回复 最后回复于 2017-9-15 14:55

wangsheng0726 发表于 2017-9-15 14:55:54 | 显示全部楼层
lncRNA的研究越来越热门,CRISPR/CAS9技术的出现,为其研究提供了新的方向,OneShine CRISPR/CAS9 lncRNA过表达细胞库进一步为该研究贡献了光和热shy
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