一键导航
您当前所在位置:乐研生物 生物圈 技术交流 分子生物学


OneShine™CRISPR/Cas9基因过表达细胞文库

OneShine™CRISPR/Cas9基因过表达细胞文库

图一lentiSAMv2质粒    图二lentiSAMv2质粒示意图


OneShine™CRISPR/Cas9基因过表达细胞文库

OneShine™CRISPR/Cas9基因过表达细胞文库



图三lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒
此系统包括lentiSAMv2质粒和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒。lentiSAMv2质粒如图一所示,其中,eSpcas9(1.1)也叫做dCas9,是将Cas9酶切位点突变后形成的,它只具有结合基因组和sgRNA的能力,而不具备切割DNA的能力。lentiSAMv2质粒的sgRNA经过改造,在sgRNA后面加入了19个碱基(MS2 binding site)。这19个碱基经过转录后形成一个具有茎环结构的RNA,此RNA能特异性地与MS2蛋白结合。而在另一个载体lenti MS2-P65-HSF1_Hygro质粒上,MS2蛋白已经与P65、HSF1蛋白融合。其中,P65、HSF1是两个转录因子。因此,当两个载体同时进入同一个细胞后,lentiSAMv2质粒表达“sgRNA- MS2 binding site“融合RNA及dCas9蛋白,lenti MS2-P65-HSF1_Hygro载体表达MS2-P65-HSF1融合蛋白。在dCas9作用下,则形成“基因组DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2- P65-HSF1”这一超级复合体。当sgRNA为转录起始位点时,此超级复合体定位于转录起始位点,由于P65、HSF1可以募集更多转录因子,因此可启动转录,从而激活转录起始位点后面的基因表达。
      我们合成了7万多个转录起始位点的sgRNA(对应2万多个基因),分别载入lentiSAMv2质粒中,再把此7万多个质粒混合起来,形成文库。并将此文库整合到了细胞中,一个125cm2细胞培养瓶中含有约10^8个细胞,每个细胞被激活一个基因,共约2万个基因被激活,所以含有每个特定激活基因的细胞约有5000个(10^8/2万)。

二、参数

(1)靶基因物种:人
(2)靶基因数目:23,430
(3)gRNA数目:70,290
(4)细胞类型:胃癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞系和永生化的细胞系。
(5)价格:7万元/株
   三、应用
  【应用举例:细胞凋亡相关基因筛选】
  取细胞文库进行扩增,然后平均分成两份,每一份包含108个细胞,每个细胞被激活了一个基因,共约2万个基因被激活,所以含有每个特定激活基因的细胞约有5000个(108/2万)。向其中一份细胞中加入放线菌素D、诱导细胞凋亡(A组),在另一份细胞中加入溶剂、作为对照(B组)。A组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞A1、未凋亡细胞A2。B组用流式细胞仪筛选出凋亡细胞B1、未凋亡细胞B2。分别对A1、A2、B1、B2进行短测序,检测哪些基因被激活了。A2中被激活的细胞即为能抵抗凋亡的基因,B1中被激活的基因即为能诱导凋亡的基因。其它应用:
  (1)新药靶点确定与验证;  (2)环状RNA上游调控机制分析、下游调控机理分析
  (3)Long noncoding RNA作用机制验证;  (4)脂肪代谢机制研究;
  (5)干细胞自我更新、不对称性分裂机制等。
该内容最后由 wangsheng0726 于 2017-9-4 17:36 编辑

分享到:

乐研生物版权申明
©本文源自乐研生物,转载请注明©
如该文侵犯了您的版权,请联系管理员

共 0 个关于【OneShine™CRISPR/Cas9基因过表达细胞文库】的回复 最后回复于 2017-9-4 17:17

您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入乐研 qq_login

本版积分规则

发新帖

版块推荐乐研BOX

精彩推荐

更多>
关注乐研生物微信 关注乐研生物微博 扫描关注乐研生物微信/微博
Copyright (C) 2012-2019 www.loybio.com, All rights reserved
Powered by Discuz!   渝ICP备12003567号-4
请勿发布违反中华人民共和国法律法规的言论,会员观点不代表乐研生物官方立场。
beian

渝公网安备 50010602500619号

返回顶部
手机端微信扫描,关注乐研生物微信

关注乐研生物微信
体验移动化生物科研

关注乐研官方微信 快速回复 返回列表