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导读|新年伊始,广受质疑的“韩春雨”事件并没有随着2016年的逝去而谢幕,反而有愈演愈烈的趋势。

2016年5月韩春雨课题组在国际顶级期刊《自然-生物技术》上发表了NgAgo基因编辑技术的论文,被国内部分媒体誉为“诺奖级”学术成果。

然而始料未及的是论文发表三月后,不少国内外实验室纷纷表示,未能根据韩春雨所提供的数据和方法重复其实验,质疑接踵而至。

本来时近年底,大家都忙着为自己的新年新人生做规划,要忘记这一事件了,偏韩国教授在2017年1月20日发表论文证明“NgAgo介导的DNA依赖的RNA切割是有效的”之后,韩春雨事件又一次进入了公众的眼界,颇有你方唱罢我登场的阵势,同时也将事件的发展推入了扑朔迷离的境况,那随后这一事件的发展只能应了一句话——欲知后事如何只能听下回分解啦!

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1月20日,美国冷泉港实验室(CSHL)旗下的预印本网站 BioRxiv 发表了一篇来自韩国基础科学研究院基因组工程中心、科学技术联合大学院和韩国国立首尔大学化学系 Jin-Soo Kim 课题组的题为“DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的文章,该文指出NgAgo介导的DNA依赖的RNA切割是有效的。

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值得注意的是该文的通讯作者Jin-Soo Kim正是2016年11月28日领衔在Nature Biotechnology杂志发表题为“Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”的 correspondence类型的文章,直指 NgAgo 不能够进行基因编辑。Jin-Soo Kim 一直是基因编辑领域的大腕,在 NBT 和其他一流杂志上曾发表过多篇关于基因编辑的重要文章。

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Jin-Soo Kim 课题组在预印本网站 BioRxiv 发表的文章在摘要中清晰的指出,NgAgo 能够作为一种 DNA 引导的核酸内切酶靶向性切割 RNA 而不是 DNA(下图)。作者证实了 NgAgo 能在体外与5’ 羟基化或者磷酸化的单链DNA 组合,将RNA 切割成两个或多个片段。

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NgAgo 在 gODN 的作用下能够特异性的切割对应基因的 RNA 转录本,显然并不作用于单链 DNA(ssDNA)或者双链 DNA(dsDNA)(下图)。

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上述结果很好的解释了为什么此前许多实验室都能够做出韩春雨去年5月2号发表在 NBT 中的 Figure 3图,既降低外源 GFP 的表达。这也解释了去年11月11日Cell Research以 Letter to Editor 形式在线发表的来自南通大学和复旦大学研究人员合作完成的题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的论文中发现gDNA/NgAgo 系统在斑马鱼中能实现特定基因敲低导致鱼眼部发育缺陷,但是不能对靶基因进行基因编辑。此外,更早以前北大魏文胜实验室运用gDNA/NgAgo 系统也能看到目的基因的表达下调但不能实现DNA编辑。韩国科学家的这项研究可能为gDNA/NgAgo 系统的基因编辑引发的系列争议给出了比较好的解释和实验证据,看来 gDNA/NgAgo 系统确实能在体外很好的实现RNA的编辑(下图)。

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关于在8月8日,韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法,其中特别提到了转染中应避免 EDTA 对镁离子的鳌合问题(Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells into the plates for transfection,引自韩春雨向Addgene提交的新版实验方法)。在预印本的这篇文章中专门设计了实验证明在体外实验中,在有 EDTA 的情况下,NgAgo 确实不能切割 RNA(下图)。

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比较好玩的一点是,NgAgo 能重复使用,反复切割。相比之下一个 Cas9 分子只能使用一次(下图)。

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作者在文章最后的讨论部分提到,NgAgo 系统可以用来作为生物医学研究的一种 RNAi 工具来介导特异性的 mRNA 或者 lncRNAs 的降解。

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要点:该课题组可能为了抢速度,直接把论文公布在预印本网站上而不是走同行评议渠道发表在正式的期刊上,关键一点是上述实验都是在体外进行的,所以后续还需要进一步在体内进行验证。鉴于课题面临的竞争,想必还有其他课题组也在完成类似的工作。让我们拭目以待吧!


论文基本信息

【题目】DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute

【作者】YeSunghyeok, BaeTaegeun, KimKyoungmi, HabibOmer, LeeSeung Hwan, KimYoon Young,LeeKang-In, KimSeokjoong, KimJin-Soo

【期刊】BioRxiv (预印本网站)

【日期】20 Jan 2017

【DOI】https://doi.org/10.1101/101923

【摘要】We show here that, unlike most other prokaryotic Argonaute (Ago) proteins, which are DNA-guided endonucleases, the Natronobacterium gregoryi-derived Ago (NgAgo) can function as a DNA-guided endoribonuclease, cleaving RNA, rather than DNA, in a targeted manner. The NgAgo protein, in complex with 5′-hydroxylated or 5′-phosphrylated oligodeoxyribonucleotides (ODNs) of variable lengths, split RNA targets into two or more fragments in vitro, suggesting its physiological role in bacteria and demonstrating a potential for degrading RNA molecules such as mRNA or lncRNA in eukaryotic cells for study of their functions.

【原文链接】http://biorxiv.org/content/early/2017/01/20/101923


通讯作者简介:


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韩国先进技术研究所基因编辑研究中心主任

Jin-Soo Kimis an entrepreneur and chemist-turned-biologist. He graduated from Seoul National University in 1987 with a major in chemistry. He then earned a master’s degree in chemistry fromSeoul National Universityin 1989 and a Ph.D. in biochemistry from the University of Wisconsin-Madison in 1994. After postdoctoral training atHoward Hughes Medical Institute/Massachusetts Institute of Technology, he came back to Seoul in 1997 to serve as Principal Investigator at Samsung Biomedical Research Institute. He co-founded a biotechnology company, ToolGen, Inc., focused on zinc finger technology in 1999, and served as CEO and CSO for the subsequent 6 years. He joined the faculty of the Department of Chemistry at Seoul National University in 2005. He now serves as Director of Center for Genome Engineeringat Institute for Basic Science. He has published over 60 articles and filed 20 patent applications, mostly in the field of gene regulation and genome editing. He has been a member of Faculty of 1000 since May, 2013.


(致谢:夏迪、蒋威二位博士对本文有重要贡献!)



来源:科研圈

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共 0 个关于【NgAgo 或只能切割 RNA | BioRxiv 论文推荐】的回复 最后回复于 2017-4-1 15:44

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