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T载体的定义:

T载体(T-Vector)是一种高效克隆 PCR 产物(TA克隆)的专用质粒载体,为线性化载体,无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接,属于非定向克隆。

T-Vector示意图

T-Vector示意图


T载体的作用原理:

大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性(下图红色框内所示位置)。因此,人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基(下图两个红色箭头所示),从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对,提高了PCR产物连接和克隆的效率。

T载体插入位点示意图

T载体插入位点示意图


T载体进行TA克隆的优势:

相对于另一种非定向克隆——平末端克隆,使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。有研究曾证明,平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50,且自身环化率高。

T载体的制备:

  • 商业化T载体:
一般来说,商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶(如EcoRV)将克隆载体进行线性化,然后再单独加入dTTP和Taq酶72~75℃反应,进行末端的加T。[1]

  • 自制T载体:
一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段,最常用的内切酶为XcmI[2],其识别和切割特点如下:

XcmI的识别特点

XcmI的识别特点

其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG,而切割序列则为中间三角箭头所指的N(N代表任意碱基)。由于N可以是任意碱基,所以如果将切割位置的N设置为T,那么在该酶的切割下,就可以产生一个3’ T末端。相似的,在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点(保证切割位点为T即可)就可以产生另一个T末端。一般可以在商业化的T载体基础上进行改造,通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存,使用时用XcmI进行完全酶切(这里的酶切必须保证完全,否则载体易自连,所以XcmI酶最好过量,或者适当延长消化时间),就可以制备得到T载体。[3]

常见T载体及序列:

虽然上面提到可以自制T-Vector,但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜,而且批次间稳定性保持的不错。最常见的T-Vector要属Takara公司的pMD系列(pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T以及对应的去除多克隆酶切位点的Simple载体,如pMD19-T-Simple[4])和Promega公司的pGEM系列(pGEM-T和pGEM-T Easy)[5]
以下分别是两种T载体的序列:(序列已经经过调整,直接将需要插入的片段粘贴到序列的头端或者尾端即可得到最终的质粒序列)
  • Takara公司pMD19-T载体序列
此处为省略显示,如需查看请回复

  • Promega公司pGEM-T载体序列
此处为省略显示,如需查看请回复

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共 99 个关于【T载体克隆连接原理、制备及载体序列】的回复 最后回复于 2017-8-29 18:41

拾阶 发表于 2014-1-13 23:42:35 | 显示全部楼层
现在编辑器加了引用功能还挺好用的,比较方便引用参考资料了
分丝 发表于 2014-1-13 23:42:57 | 显示全部楼层
总结的很好,虽然平时都在用T载体,但还真没总结过这些
97#加满 发表于 2014-1-13 23:53:14 | 显示全部楼层
还能自制T载体,以前还真没留意过,都是没钱给逼的
周八戒 发表于 2014-1-14 20:36:58 | 显示全部楼层
这个好,支持一下
择日失恋 发表于 2014-1-16 17:55:36 | 显示全部楼层
看看序列,刚好用到!
唐白虎点蚊香 发表于 2014-2-2 20:18:05 | 显示全部楼层
虚心向楼主学习
影响力为零 发表于 2014-2-5 12:50:00 | 显示全部楼层
向楼主的分享精神致敬
hblxy 发表于 2014-2-6 00:24:36 | 显示全部楼层
很好,楼主说的非常对
好兄弟 发表于 2014-2-14 07:24:41 | 显示全部楼层
向楼主的分享精神致敬
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