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绿色荧光蛋白GFP

研小弟 于 2013-11-5 22:25 发表 [复制链接]

发现:

绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是在美国西北海岸所盛产的一种名为Aequorea victoria的水母中发现的一种可以发出绿色荧光的蛋白质。GFP最早是在1962年由日本科学家下村修发现,是由238氨基酸组成的单体蛋白质,蛋白分子量约为27kD。GFP的晶体结构显示,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420nm,宽240nm,由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于桶的大空腔内。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性,去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸,GFP均会失去荧光。原因是GFP生色团的形成效率较低,而且形成过程受外界环境影响较大。

GFP的结构图

GFP的结构图

发光原理:

GFP的第65至67位的三个氨基酸(丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下,发色团可进一步发生氧化脱氢,最终成熟,形成可发射荧光的形式。具体过程为:在 O2存在下,GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击,形成第5位碳原子咪唑基;第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合,并最终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。


GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光,中度氧化剂如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。


发光特性:

GFP吸收的光谱最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。此外,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如萤火虫荧光素酶等。


应用:

广泛应用于分子标记,体内示踪,信号转导,药物筛选等生物科研的各个方面。

右侧为GFP转基因小鼠,左侧小鼠为正常对照

右侧为GFP转基因小鼠,左侧小鼠为正常对照


诺贝尔奖:

由于GFP的广泛应用以及在生命科学科研中发挥的巨大作用,2008年诺贝尔化学奖授予了,发现并发展了绿色荧光蛋白(GFP)的三位科学家,分别是日本科学家Osamu Shimomura(下村修)、美国哥伦比亚大学的Marin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien(钱永健,钱学森堂侄)。


序列:

野生型GFP(wtGFP)全长717bp,序列为:

此处为省略显示,如需查看请回复


变体:

在GFP发现的半个世纪中,陆续衍生了多个变体,其中最著名的要属其红移变体——增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP;EGFP的最大吸收峰位于488nm)。其他还包括发射荧光也发生改变的变体,包括蓝色荧光蛋白:EBFP,EBFP2,Azurite,mKalama;青色荧光蛋白:ECFP,Cerulean,CyPet;黄色荧光蛋白:YFP,Citrine,Venus,YPet等等。

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共 37 个关于【绿色荧光蛋白GFP】的回复 最后回复于 2018-10-9 20:49

zhouleiwang 发表于 2014-1-3 00:57:14 | 显示全部楼层
介绍的相当全面,顶。
完美再现 发表于 2014-1-3 12:38:36 | 显示全部楼层
EGFP和野生型的GFP有多大区别啊?
97#加满 发表于 2014-1-11 22:04:16 | 显示全部楼层
不错!顶楼主
及时雨 发表于 2014-1-13 20:24:37 | 显示全部楼层
总结的很好!非常感谢!
锤子 发表于 2014-1-20 09:47:10 | 显示全部楼层
虚心向楼主学习
首席菜鸟 发表于 2014-1-20 11:24:46 | 显示全部楼层
真心有用,特地注册表示感谢
陌路人 发表于 2014-1-20 13:02:18 | 显示全部楼层
谢谢楼主,收藏
原野的角落 发表于 2014-1-22 01:15:48 | 显示全部楼层
真心有用,特地注册表示感谢
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