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标准曲线的建立
PCR扩增效率是指多聚酶把各种试剂(dNTP,寡核苷酸和模版cDNA)转变生成扩增子的效率。每个循环扩增子的最大增量为两倍即代表PCR反应的效率是100%。检测PCR反应的扩增效率非常重要,因为扩增效率可反映人为原因引起的荧光定量PCR(qPCR/RT-PCR)问题。低扩增效率(<90%)可能由于Tag酶抑制剂的污染,过高或未优化的退火温度,时间较久或已失活的Tag酶,引物设计不合理或扩增子含二级结构。过高反应效率(>105%)一般是由于引物二聚体或非特异性扩增。而引起过高或过低的反应效率最常见的原因包括移液器不准或不当的移液器操作技术。

标准曲线一般被用来确定荧光定量PCR的反应效率。标准曲线所用的模版一般是cDNA或质粒cDNA。我们建议实验开始时从cDNA样品的最高浓度开始,可设置8个10倍系列稀释的点来确保标准曲线能覆盖实验中所有可能会用到的模版浓度(即形成宽的动态范围)。对每个稀释度来说,标准荧光定量PCR流程中每个引物对要重复三次来确定Cq值。标准曲线是模版起始浓度的对数值对Cq值得到的。其后所得的线性回归直线的方程,Pearson相关系数(r)或决定系数(R2)可用来荧光定量PCR反应是否需要优化。

理想情况下,一系列稀释样品产生的扩增曲线重复应是分布均匀的。如果每次扩增都是两倍增长,那么荧光曲线之间的间隔可用公式2n=稀释因子确定,这里n是各曲线在荧光阀值时的循环数差(即不同曲线之间Cq值的差值)。例如,DNA为10倍梯度稀释,则2n=10,因此n=3.32,即表示不同曲线的Cq值之间相差为3.32个循环。均匀间隔的扩增曲线可产生线性的标准曲线,其反应效率在90-105%之间。

qPCR的标准曲线

qPCR的标准曲线


标准曲线的r或R2可代表实验数据符合回归曲线的程度,即数据的线性化程度。线性化可检测重复孔之间的差异性,不同其实模版拷贝数的扩增效率是否一致。重复孔之间如果有明显的Cq值差异,r或R2值会降低。荧光定量PCR反应的理想r绝对值应>0.990或R2值应>0.980.删除标准曲线两末端的点可以得到可接受的斜率值(效率)和R2值。标准曲线将最终确定每对引物对适用的cDNA浓度动态范围,这关系到样品的稀释。
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共 0 个关于【荧光定量PCR标准曲线的建立-评价PCR扩增效率】的回复 最后回复于 2013-4-11 20:16

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