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siRNA细胞转染操作步骤

xiaoyu 于 2019-9-3 09:31 发表 [复制链接]

下面以Entranster-R4000试剂为例,说一下siRNA转染步骤(24孔板)

1.提前1天细胞种植

贴壁细胞:提前一天将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞汇合度(Confluence)在30%左右为宜,转染前全培养基总量为0.45ml。

悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程  

⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。

注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵取1ul的Entranster-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成Entranster-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。

⑶将Entranster-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。

注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。

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