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elisa试剂盒中的固相载体

十一 于 2013-8-21 11:23 发表 [复制链接]

固相载体

可作为elisa试剂盒中的固相载体的物质很多,例如聚乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、玻璃和硅橡胶等,但现已不多用。理想的elisa板应该是吸附性能好、空白值低、透明度高、各孔的大小和性能相同、目前最常用的是聚苯乙烯,他有较强的吸附蛋白质的性能,并且不损害蛋白质的免疫活性,不影响elisa过程中的免疫反应和显色反应,价格低廉,来源容易,因此被普遍采用。


固相载体的特征

elisa试剂盒中的载体的形状主要有3种:微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用,专用于elisa试剂盒的产品称为elisa板,国际上标准的微量滴定板为8乘以12的96孔式。为便于做少量标本的检测,有制成8联孔条或12联孔条的,放入座架后,大小与标准elisa板相同。elisa板的特点是可以同时进行大量标本的检测,并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的elisa检测,包括加样、洗涤、保温、比色等步骤,对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后,其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加,应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多,但用于间接法测抗体时空白值较大。


良好的elisa试剂盒板应该是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之见性能相近。聚苯乙烯elisa板由于原料的不同和制作工艺的差异,各种产品的质量差异较大,因此,每一批号的elisa试剂盒板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为10ng/mL)包被elisa板各孔,洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体,保温后洗涤,加底物显色,终止酶反应后,分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件,使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差,应小于10%。


与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为elisa试剂盒固相载体,聚氯乙烯的特点为质量板薄,可剪割,价廉,但光洁度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。


为比较不同固相在某一elisa试剂盒测定中的优劣,可应用如下的试验:用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本,将它们进行一系列稀释后,在不同的固相载体上按预定的elisa操作步骤进行测定,然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大,这种载体就是这一elisa试剂盒测定项目的最合适的固相载体。


在elisa中,用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠,表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者,球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态,因此珠式elisa的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底,使用特殊的洗涤器,使小珠在洗涤过程中滚动淋洗,其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大,小珠的均一性较差。


小试管作为固相载体也有较大的吸附表面,而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式elisa试剂盒的标本量一般为100-200ul,而小试管可根据需要加大反应体积,标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当做比色杯,最后直接放入分光光度计中比色。


也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为elisa试剂盒固相载体的。其优点是表面积大,反应在悬液中进行,其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为elisa固相载体,反应后用磁铁的吸引进行分离,洗涤方便,试剂盒一般均配以特殊仪器。


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