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定义:

一种测定细胞内beta-catenin介导的转录活性的方法(经典wnt信号通路)!


创立者:

最早由Hans Clevers实验室构建,但其信噪比不佳,后面由Ajamete Kaykas改良!


原理:

经典的Wnt信号通路需要beta-catenin入核,进而与转录因子TCF/LEF结合形成复合物,共同起始下游调控基因的转录。据此,科学家通过将数个拷贝的TCF/LEF DNA结合位点(AGATCAAAGGgggta,大写碱基为DNA结合序列,小写的碱基为间隔序列)克隆至含TA病毒最小启动子(minimal TA viral promoter )的萤火虫荧光素酶报告系统载体中,构建得到TOP-Flash质粒。该质粒可依据beta-catenin的活性强弱,调控下游萤火虫荧光素酶的表达量高低。进而将实验简化为检测荧光素酶的活性。同时为了减少误差,该系统还设计了包含突变的TCF/LEF DNA结合位点的对照质粒,即FOP-Flash载体。

由于荧光素酶报告系统的高灵敏性,为了减少操作误差,我们在平时使用时,往往还需要连同一个表达海肾荧光素载体,作为内对照,从而消除细胞活力、转染效果、裂解效果等系统误差(同双荧光素酶报告基因检测系统)!具体的TOP或FOP质粒与海肾荧光素载体的比例,需要个人通过实验优化,通常取值的范围在10/1到50/1。


数据处理:
通常以TOP/FOP的比值表示。

公式如下:
转染有TOP-Flash和海肾荧光素载体的样本中采集得到的萤火虫荧光值 F(Top)/采集得到的海肾荧光值R(Top)
转染有FOP-Flash和海肾荧光素载体的样本中采集得到的萤火虫荧光值 F(Fop)/采集得到的海肾荧光值R(Fop)

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共 3 个关于【TOP-Flash&FOP-Flash(测定细胞内Wnt信号通路活性)】的回复 最后回复于 2012-6-26 18:59

再多呆一天 发表于 2012-5-29 15:50:08 | 显示全部楼层
为啥子还整个隐藏哦,过来学习一下!sweat
统统 发表于 2012-5-29 19:17:59 | 显示全部楼层
哦,终于明白了,楼主辛苦smile
拾阶 发表于 2012-6-26 18:59:10 | 显示全部楼层
再多呆一天 发表于 2012-5-29 15:50 icon
为啥子还整个隐藏哦,过来学习一下!

嗯,还是取消隐藏!biggrin

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